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《第二代测序信息处理》几乎涵盖了NGS 技术在生命科学领域的全部应用，包括从头测序（含基因组注释）、针对稀有变异检测和元基因组研究的扩增子测序、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、RNA 测序（RNA-seq）和肿瘤体细胞变异检测（包括单碱基替换、插入、缺失和易位）等。通过广泛使用的一线软件充分讨论数据分析方法，详述*工作流程（包括部分学习指南），实用性强、可靠性强、专业指导性强。

目录

《新生物学丛书》丛书序

译者前言

前言

1 DNA测序简介 Stuart M. Brown 1

2测序信息学的历史 Stuart M. Brown 21

3 第二代测序数据的可视化 Phillip Ross Smith，Kranti Konganti和 Stuart M. Brown 34

4 DNA序列比对 Efstratios Efstathiadis 48

5 用广义 de Bruijn有向图算法组装基因组 D. Frank Hsu 62

6 用短序列读段从头组装细菌基因组 Silvia Argimon和 Stuart M. Brown 73

7 基因组注释 Steven Shen 84

8 使用第二代测序技术检测序列变异 Jinhua Wang，Zuojian Tang和 Stuart M. Brown 96

9 ChIP-seq Zuojian Tang，Christina Schweikert，D. Frank Hsu和 Stuart M. Brown 104

10 使用第二代测序进行 RNA测序 Stuart M. Brown，Jeremy Goecks和 James Taylor 129

11元基因组学 Alexander Alekseyenko和 Stuart M. Brown 143

12 DNA测序信息学中的高性能计算 Efstratios Efstathiadis和 Eric R. Peskin 149

术语表 165

索引 174

彩图

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1DNA测序简介

Stuart M. Brown

DNA测序简史

人类基因组计划（Human Genome Project，HGP，1995~2003）中所有 DNA测序工作都是通过 Frederick Sanger在 1975年发明的测序法加以改进而完成的（ Sanger and Coulson 1975）。在 Sanger的工作之前，部分核苷酸序列通过 RNA合成和酶消化的点对点（ ad hoc）方法测定。 1971年康奈尔大学的 Ray Wu发表过类似 Sanger法的测序法（Wu and Taylor 1971），他通过 DNA聚合酶向单链末端增加带有放射性标记的互补核苷酸，用酶切反应和色谱法等一系列方法，成功测定了噬菌体 λDNA单链末端的 12个碱基。 1973年，Walter Gilbert 和 Allan Maxam发表了大肠杆菌（ Escherichia coli）基因组中乳糖操纵子（转录阻遏物结合位点）的 24个碱基序列（ Gilbert and Maxam 1973）。他们使用了一系列复杂的混合方法，包括部分酶切消化的嘧啶指纹、色谱法和体外转录 RNA分子的酶切反应等。比利时根特大学的 Walter Fiers和同事测定了噬菌体 MS2外壳蛋白的所有序列（ Min Jou et al. 1972）。该方法基于噬菌体 RNA的核酸酶消化作用，部分依赖于通过 RNA聚合酶和不完整核苷酸混合物在体外合成 RNA，并对 RNA片段进行化学测定。 Fiers使用已知蛋白质序列信息来限制可能的密码子，并且组装重叠片段。

Sanger在 1975年发明的测序法通过 DNA聚合酶使人工合成的短寡聚核苷酸引物延伸，与单链 DNA模板杂交，合成新的 DNA片段。Sanger测序法的个版本使用双阶段 DNA合成反应。在阶段，测序引物利用 4种三磷酸脱氧核苷酸（ dATP、 dCTP、dGTP和 dTTP）的混合物进行部分延伸，生成一批新合成的 DNA片段，它们全部以引物为起始，延伸至“随机”长度。在第二阶段，部分延伸的模板被分成 4个平行的 DNA合成反应，每个反应只包括 4种三磷酸脱氧核苷酸中的 3种。“合成并尽可能在每条链上持续延伸：因此，如果 dATP是未加入的那个三磷酸盐，每条链都会在 3′端终止于 A残基前的位置”（Sanger and Coulson 1975）。接着，新合成的 DNA片段从模板链变性分离，通过丙烯酰胺凝胶电泳在相邻泳道根据片段大小进行分离。“理想的情况下，能够通过放射自显影图像读取 DNA序列”（Sanger and Coulson 1975）（图 1.1）。

从各个角度来看，Sanger测序法都是具有革命性意义的。其中昀重要的是，它能对任何 DNA分子进行测序，它可以用来检测长 DNA序列。然而，这个系统在首次提出时有两个严重局限，导致它并未立刻被广泛采用。，对于寡聚核苷酸引物的需求意味着必须有一段与待测 DNA序列区域直接相邻的 DNA序列是已知的；第二，引物的“随机延伸”未必能生成平均分布的所有理论长度片段。

在 Sanger的“引物延伸”测序法发表短短两年后， Allan Maxam和 Walter Gilbert发明了一种基于 DNA化学裂解的测序方法（ Maxam and Gilbert 1977）。Maxam-Gilbert测序与 Sanger法类似，将 DNA模板分成 4个反应。在每个反应中，先在模板的 5′端进行放射性标记，再加入能特异性在其中一种碱基处切开 DNA的化学试剂。反应进行时，平均一个 DNA分子只在随机位点产生一次裂解。接着，和 Sanger法一样将 4个反应的产物加在丙烯酰胺凝胶的相邻泳道，通过电泳根据片段大小进行分离。昀后，通过对丙烯酰胺凝胶的放射自显影图像读取 DNA序列。起初，Maxam和 Gilbert测序相对于 Sanger测序更受欢迎，因为它能直接通过纯化后的 DNA片段进行测序，而不需要单链模板和互补寡聚核苷酸引物。

Sanger随即改进了他在 1975年提出的方法，他在引物延伸反应中使用双脱氧核苷酸作为“链终止子”代替复杂的双阶段反应（ Sanger et al. 1977）。改进后的测序法仍以单链 DNA模板和短互补寡聚核苷酸引物的杂交为起始。将杂交后的模板分成 4组反应混合物每组包括 DNA聚合酶、 4种三磷酸脱氧核苷酸（其中一种用放射性同位素标记）和一种双脱氧核苷酸。当引物在 DNA聚合酶作用下延伸时，一旦连接上双脱氧核苷酸反应就会停止，随即生成不同长度的、以同样引物为起始、以同一碱基终止的短片段混合物。昀后，将 4个反应生成物加在丙烯酰胺凝胶上，通过电泳分离大小不同的片段，通过放射自显影图像读取 DNA序列。Sanger表示在一次电泳中能读取昀多 300个碱基的长度。

很多年来，Sanger的双脱氧核苷酸末端终止测序法和 Maxam-Gilbert的化学降解测序法一直被互相比较。也许是由于 Maxam-Gilbert法步骤烦琐并使用了有毒试剂，Sanger法越来越受欢迎。很多细化完善 Sanger法的研究方法被开发出来，包括多种跨待测基因（或整个基因组）的单链模板克隆方法和进行试剂准备流水作业的商业试剂盒。一项对 Sanger技术非常重要的改进是荧光染料取代了新合成 DNA片段上的放射性同位素标记（Smith et al. 1986）。由此促使 Leroy Hood、Michael Hunkapiler等开发出半自动 DNA测序仪，并且由美国应用生物系统公司（ Applied Biosystems Inc.，ABI）投入商业化生产。

ABI测序仪的重要创新包括将 4种不同颜色的荧光标记连接在 4种双脱氧核苷酸链终止子上，使 4个碱基终止的片段都在同一个反应管中生成，并且在同一块丙烯酰胺凝胶上进行电泳，通过电脑监控进行实时荧光检测，这样在凝胶电泳进行时序列数据就能被自动收集。人类基因组计划数据基本上都是由这些 ABI测序仪获得的。ABI自动荧光测序仪的另一处改进是用毛细管取代两个玻璃盘之间又大又薄的平板来盛放丙烯酰胺凝胶。这为测序实验室的技术人员节省了准备工作，保证了电泳结果的持续稳定并且提高了电泳速度，也使测序仪能够同时处理更多的样本（图 1.2）。

测序克隆

Sanger测序反应需要单链 DNA模板、与模板互补的短单链寡聚核苷酸引物、 DNA聚合酶及链延伸和链终止的核苷酸混合物。准备测序 DNA的常规策略是将 DNA的目标片段克隆到质粒载体上，质粒载体在可以被单链 DNA聚合酶Ⅱ使用的标准测序引物结合位点之间提供克隆位点。由此任何 DNA目标片段都可以通过标准寡聚核苷酸引物从两个方向被测序，因此不需要提前知道目标 DNA分子的序列（图 1.3）。用 Sanger法进行 DNA测序一次能读取 500~800个碱基，这个界限受两个因素影响，一是 Sanger引物延伸/链终止反应，二是通过单碱基分辨率用电泳准确区分 DNA片段的能力。由于多数研究人员感兴趣的生物学核酸分子（如基因、 mRNA转录物、质粒和基因组）都远比 800 bp长，DNA测序项目一般先将 DNA分子打成短片段，对短片段进行测序，再用生物信息学工具将数据组装成目标分子的完整序列。

对于较小的测序目标，基于限制性消化片段的策略颇为有效，但是却难以追踪所有序列组成片段的大小和方向。Henikoff在 1984年提出的策略包括通过核酸外切酶Ⅲ的有向消化生成逐级变小的 DNA片段，再将这些巢式序列通过重叠 read组装被构建成为重叠群（contig）的邻接序列。由于所有 DNA测序法都会产生少量错误，逐渐形成的标准流程是将全部目标区域中重叠的 read结合起来，在理想状态下 read来自 DNA分子的两个方向。将全部来自两个方向的重叠 read组装成为共有序列的方法成为 20世纪八九十年代软件开发的焦点。一篇发表于 1994年的综述（ Miller and Powell 1994）比较了 11个不同 DNA序列组装软件的性能。

图 1.3 把 DNA片段克隆到 M13测序载体的多克隆位点上

测序项目的片段组装在算法上和序列比对相似，但也有其独特之处。首先，由于每一个 read都由克隆到质粒（或病毒）载体上的 DNA片段产生，读到的前几个碱基经常包含测序载体的序列。当克隆片段的长度比 read短时，read结尾也常包含载体。而当整个测序区域只包括载体 DNA时，有可能会造成克隆干扰。所以，在将 read组装成 contig之前，从原始序列数据中识别和移除所有载体序列是很有必要的。

其次，通过 Sanger法获得的 DNA序列质量不稳定。由于电泳造成的不均匀分离、游离引物所引起的噪声，以及引物二聚体干扰，read的前 50个碱基质量较低。 read的末端（超过 500个碱基）质量也较低，这是因为长片段 read数量减少会导致信号减弱和扩散，以及电泳时微小的迁移率差异所导致的片段分离不明显。在理想状态下，序列组装软件应当具有识别低质量区域的能力，并且提供将低质量区域从高质量序列中分离出来的工具。

随着序列组装软件的发展，为大型测序项目开发的新策略应运而生。研究人员认识到 DNA可以被随机打断成一系列无序片段，而无需小心翼翼地克隆限制性片段或使用核酸酶消化成巢式缺失片段。然后将这些无序片段克隆并测序，再通过软件组装，寻找其中重叠的部分（见第 5章）。这整个过程被称为鸟枪法测序（Anderson et al. 1982）。用鸟枪法测得的 DNA片段在目标 DNA分子上呈泊松分布，所以需要对足够多的 DNA片段进行测序，才能使原分子的每个碱基都有足够的覆盖度，进而拼出完整的 contig。例如，一个 10 000个碱基的 DNA目标片段（ 10 kb），需要对相当于全长 8~10倍数量的片段进行测序。鸟枪法策略与需要大量人力进行限制性片段和巢式缺失克隆的测序方法相比，每一轮测序费用更加低廉，这使得鸟枪法策略越来越受欢迎。

对于非常大型的测序项目（全基因组），一种分而治之（divide-and-conquer）的策略经常被采用。把从 10万~100万个碱基不等的大片段 DNA克隆到被称为细菌人工染色体（ bacterial artificial chromosome，BAC）的载体上，再用鸟枪法对这些片段逐个测序。

即使具有较高的覆盖度（ 8×~10×），用鸟枪法组装的重叠的 read也会在目标基因区域的序列中留下一些空位。可能是片段的泊松分布导致的随机低覆盖度区域，也可能是序列特异效应在克隆或测序过程中影响了目标区域的某些部位。空位可以用“引物步移策略”（primer walking strategy）来填补，该策略首先需要设计特异性测序引物，通过这些引物使测序反应从 contig末端开始进行，并将序列延伸直至覆盖空位区域。随着每条 read被添加到 contig上，继续设计新的引物，直到和另一 contig相遇。在相反方向进行延伸的引物能提供双链覆盖。引物步移策略在覆盖 DNA片段的测序中所需反应数量很少，但是十分耗时，因为只有在得到上一个引物的测序数据时，才能设计和合成下一个引物（图 1.4）。

图 1.4 测序的引物步移策略

第二代测序

一些历史学家（Goldstein 1978；Kuhn 1996；Gladwell 2008）发现，当现有知识或新兴技术积累到足够充裕的程度时，会有很多不同的研究者同时钻研一个科学问题并同时产生新发现。其中比较成功的理论或方法会继续相互竞争，直到其中一个占据优胜地位，成为标准方法或主导范例。很明显 20世纪 70年代就是一个 DNA测序的革命性时代。而另一场围绕第二代 DNA测序（next-generation DNA sequcencing，NGS）的革命则正在进行。2004~2012年，由于测序仪器的通量每年都会加倍，而平均到每个碱基的测序费用每年都会减半，新的 DNA测序标准显然尚未确立。NGS技术通常具有几个

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前言

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——于军 中国科学院北京基因组研究所